Von da an mimte die Schauspielerin fast ausschließlich die "dunkelhaarige Unschuld" in so wenig anspruchsvollen Streifen wie 1954 in "Gorilla at Large" (Der Würger von Coney Island). Da sie darüber nicht wirklich glücklich war, setzte Anne Bancroft zunächst ihre Ausbildung an der "Herbert Berghof Acting School" sowie am renommierten "Actors Studio" fort. "Das Studio wollte mir diesen Monroe-Sex verpassen, ich aber wollte meine Schauspielerei weiter entwickeln und nicht meinen Körper" meinte sie einmal über diese Zeit.
Anschließend ging sie zum Broadway und gab dort 1958 überaus erfolgreich ihr Debüt als ernsthafte Schauspielerin in der Uraufführung von William Gibsons "Two for the Seesaw" (dt. "Spiel zu zweit") an der Seite Henry Fonda. 1959 erhielt sie den renommierten Theaterpreis "Tony Award"¹⁾ sowie den "New York Critics Award" für die Gearaltung der Annie Sullivan, Lehrerin der blinden und taubstummen späteren Schriftstellerin Helen Keller¹⁾ (1880 – 1968), in William Gibsons "The Miracle Worker". Diese Figur verkörperte sie dann auch 1962 in Arthur Penns Verfilmung des Theatererfolges "The Miracle Worker"¹⁾  (Licht im Dunkel²⁾) und erhielt hierfür den begehrten "Oscar"¹⁾. Damit gehört die Schauspielerin seit 1963 zu den gerade mal acht Mimen, die für dieselbe Rolle sowohl mit einem Bühnen-Tony als auch einem Film-Oscar ausgezeichnet worden waren.
Nach zahlreichen Broadway-Erfolgen zog es Anne Bancroft wieder zurück zum Film, hier spielte sie nun ähnlich emotionale Rollen wie in "Licht im Dunkeln". 1964 erhielt sie den Darstellerpreis in Cannes für ihre Darstellung in Jack Claytons "The Pumpkin Eater" (Schlafzimmerstreit) nach dem Stück von Harold Pinter und ein Jahr später war sie als neurotische kindergebärende Ehefrau und Selbstmordgefährdete in Sidney Pollacks dramatischen Geschichte "The Slender Threat"¹⁾ (Stimme am Telefon) zu sehen. 1967 erlangte Anne Bancroft weltweite Berühmtheit durch den Kultfilm "The Graduate"¹⁾ (Die Reifeprüfung2)) als skrupellos-verführerische Mrs. Robinson, die den jungen Benjamin Braddock alias Dustin Hoffman verführt (siehe auch Dustin Hoffman-Filme). Diese Rolle brachte ihr eine weitere "Oscar"-Nominierung ein, genauso wie ihre Auftritte 1977 als alternde Ballerina neben Shirley MacLaine in Herbert Ross' Meisterwerk "The Tuning Point"¹⁾ (Am Wendepunkt) und 1985 neben Jane Fonda als energische Mutter Oberin eines Frauenklosters in Norman Jewinsons Bühnendadaption "Agnes of God"¹⁾ (Agnes – Engel im Feuer).
Beeindruckend war 1980 auch ihr Auftritt in David Lynchs Drama "The Elephant Man"¹⁾ (Der Elefantenmensch), wo sie an der Seite von John Hurt und Anthony Hopkins glänzte. Unter der Regie ihres Ehemanns spielte sie beispielsweise 1983 in der Satire "To Be Or Not To Be"¹⁾ (Sein oder Nichtsein), einem Remake des gleichnamigen Klassikers¹⁾ von Ernst Lubitsch aus dem Jahre 1942 mit Carole Lombard.
1993 trat Anne Bancroft in dem Thriller "Malice"¹⁾ (Malice – Eine Intrige") neben Nicole Kidman und Bill Pullman in Erscheinung sowie 1995 in dem Drama "How to Make an American Quilt"¹⁾ (Ein amerikanischer Quilt), wo sie an der Seite von Ellen Burstyn die Großtante von Winona Ryder mimte. 1995 agierte sie dann in Jodie Fosters Tragikomödie "Home for the Holidays"¹⁾ (Familienfest und andere Schwierigkeiten), zwei Jahre später gehörte sie zur Besetzung von Sidney Lumets Komödie "Critical Care"¹⁾ (1997, Sterben und erben). Weitere sehenswerte Kinoproduktionen mit Anne Bancroft waren beispielsweise John Fords Abenteuer "Seven Women"¹⁾ (1965, Sieben Frauen²⁾), wo sie sich als furchtlose, zynische Ärztin zeigte, oder Sidney Lumets origineller Streifen bzw. Tragikomödie "Garbo Talks"²⁾ (1984, Die Göttliche).
 
Anne Bancroft war bis wenige Jahre vor ihrem Tod regelmäßig auf der Leinwand und im Fernsehen mit schönen Rollen präsent. Diese Aktivität kam vielleicht nicht zuletzt auch wegen ihrer Devise: "Life is here only to be lived so that we can, through life, earn the right to death, which to me is paradise. Whatever it is that will bring me the reward of paradise, I'll do the best I can." Letzter Höhepunkt ihrer beeindruckenden Laufbahn mit mehreren Dutzend Kinofilmen und TV-Mehrteilern war der Fernsehfilm "The Roman Spring of Mrs. Stone" aus dem Jahre 2003.
 
Die mehrfach für ihre schauspielerischen Leistungen ausgezeichnete Mimin erlag am 6. Juni 2005 im Alter von 73 Jahren im New Yorker "Mount Sinai Hospital" ihrem Krebsleiden. Die letzte Ruhe fand sie in der Nähe ihrer Eltern Mildred und Michael Italiano auf dem "Kensico Cemetery" in Valhalla (Mount Pleasant, New York) → Foto der Grabstelle bei Wikimedia Commons. 
Sie hinterließ ihren zweiten Mann, den  Schauspieler und Regisseur Mel Brooks¹⁾, den sie 1964 geheiratet hatte, sowie den 1972 geborenen gemeinsamen Sohn Max. Ihre erste 1953 geschlossene Ehe mit dem Bauunternehmer Martin May war bereits 1957 geschieden worden.
"Reifeprüfung"-Regisseur Mike Nichols würdigte Anne Bancroft in einem Nachruf als einzigartige Schauspielerin: "Ihre Kombination aus Verstand, Humor, Offenheit und Gefühl war einmalig. Ihre Schönheit hat sich ständig mit ihren Rollen gewandelt, und weil sie eine großartige Schauspielerin war, hat sie sich für jede Darstellung radikal geändert."